國寶大熊貓一向以其標(biāo)志性的黑白毛色為人們所熟知。然而，在秦嶺野生大熊貓種群中，卻出現(xiàn)了一種罕見的毛色突變體——棕白色大熊貓（以下稱棕色大熊貓）。1985年，人們在陜西佛坪自然保護(hù)區(qū)首次發(fā)現(xiàn)并救護(hù)了一只雌性棕色大熊貓“丹丹”，丹丹于2000年患病去世。2009年，雄性棕色大熊貓“七仔”在幼年時(shí)于佛坪保護(hù)區(qū)被發(fā)現(xiàn)，后被救護(hù)至陜西樓觀臺(tái)珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)中心在圈養(yǎng)環(huán)境下正常生活。迄今為止，有實(shí)體或照片的棕色大熊貓僅有七例，其中三例來自佛坪縣，兩例來自洋縣，太白、周至二縣各有一例。這種極其稀有的棕白毛色使其愈發(fā)憨態(tài)可掬，大熊貓七仔如今更是國寶中的“明星”。這種非同尋常的棕白毛色表型究竟是如何形成的，又為何僅在秦嶺山系種群中發(fā)現(xiàn)，一直是公眾和研究人員迫切渴望解開的謎團(tuán)。
中國科學(xué)院動(dòng)物研究所、江西農(nóng)業(yè)大學(xué)魏輔文院士研究團(tuán)隊(duì)長期關(guān)注秦嶺野生大熊貓中出現(xiàn)的罕見棕白毛色表型，利用在佛坪自然保護(hù)區(qū)長期收集的野生大熊貓的生態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)數(shù)據(jù)及圈養(yǎng)繁育信息，建立了與棕色大熊貓七仔相關(guān)的兩個(gè)家系，確定了棕白毛色的常染色體隱性遺傳模式?；谌鷾y序數(shù)據(jù)的染色體水平大熊貓基因組組裝、七仔兩個(gè)家系的全基因組重測序數(shù)據(jù)和種群水平的全基因組重測序數(shù)據(jù)，研究團(tuán)隊(duì)鑒定了Bace2基因第一外顯子25bp缺失突變是棕色大熊貓最有可能的遺傳基礎(chǔ)。進(jìn)一步利用RNA-seq數(shù)據(jù)、大規(guī)模種群Sanger測序和CRISPR-Cas9敲除小鼠模型對該突變進(jìn)行了驗(yàn)證，并利用光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡技術(shù)探索了棕色毛發(fā)形成的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制。
為探明大熊貓這種棕白毛色與黑白毛色的差異，研究團(tuán)隊(duì)首先對二者的黑色和棕色毛發(fā)分別進(jìn)行了細(xì)致的顯微和超顯微結(jié)構(gòu)觀察。顯微圖像顯示，棕色毛發(fā)內(nèi)的色素含量明顯少于黑色毛發(fā)。而橫縱切面的透射電鏡與統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)一步顯示，大熊貓黑色毛發(fā)中富含著色均勻的黑素體（富集黑色素的細(xì)胞器），而棕色毛發(fā)中的黑素體數(shù)量和截面積都顯著小于黑色毛發(fā)，且存在大量結(jié)構(gòu)散亂的缺陷型黑素體。
為揭示棕色大熊貓背后的遺傳模式與分子機(jī)制，研究人員基于在佛坪保護(hù)區(qū)及其周邊區(qū)域的157只大熊貓的微衛(wèi)星基因分型數(shù)據(jù)及圈養(yǎng)繁育信息，構(gòu)建出棕色大熊貓“七仔”的兩個(gè)家系，發(fā)現(xiàn)七仔的父母及后代均為黑白毛色，結(jié)合七仔和已知的丹丹家系，推斷該棕色表型是由常染色體隱性遺傳模式控制。進(jìn)一步，研究人員利用三代測序技術(shù)、Bionano、Hi-C等測序技術(shù)對七仔的父親“喜悅”的基因組進(jìn)行了從頭組裝，構(gòu)建了其染色體水平的基因組。以該基因組作為參考，結(jié)合七仔、丹丹、七仔家系的四只黑色大熊貓以及其它秦嶺和非秦嶺地區(qū)的29只野生大熊貓，共35只熊貓個(gè)體的高深度重測序數(shù)據(jù)，研究人員在大熊貓常染色體上鑒定出了大量的SNPs、small indels和結(jié)構(gòu)變異。經(jīng)過種群和家系水平的變異篩選，棕色大熊貓位于1號(hào)染色體上Bace2基因第一個(gè)外顯子上的25bp純合缺失突變最可能是其毛色變異的遺傳基礎(chǔ)。
為驗(yàn)證Bace2基因結(jié)構(gòu)的完整性，以及25bp缺失是否在棕色大熊貓中真實(shí)存在，研究團(tuán)隊(duì)檢查了所有重測序個(gè)體在該區(qū)段的測序深度，并利用轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)確認(rèn)了Bace2基因結(jié)構(gòu)的完整性，同時(shí)在RNA水平驗(yàn)證了該突變在棕色大熊貓中真實(shí)存在。為進(jìn)一步探究該缺失突變與棕色變異關(guān)聯(lián)的可靠性，研究團(tuán)隊(duì)對其它192只秦嶺、非秦嶺、或雜交的黑白大熊貓Bace2基因的該缺失變異區(qū)段進(jìn)行PCR和Sanger測序,結(jié)合35只全基因組重測序個(gè)體共227只大熊貓個(gè)體，最終確認(rèn)僅兩只棕色大熊貓存在純合25bp缺失，四只秦嶺黑白色大熊貓和圈養(yǎng)大熊貓秦華為雜合子，而其它黑白色大熊貓均為野生型純合子。
為驗(yàn)證大熊貓Bace2基因的25bp缺失對毛色表型的影響，研究人員使用CRISPR?Cas9基因編輯技術(shù)在C57BL/6J品系小鼠中構(gòu)建了同源區(qū)段敲除的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)所有Bace2-/-小鼠的毛色淺于野生型毛色。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，相較于1月齡生長期，4月齡休止期的小鼠毛發(fā)中色素缺乏的情況更為顯著。對小鼠背部毛發(fā)進(jìn)行透射電鏡觀察并統(tǒng)計(jì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的黑素體數(shù)量和截面積，Bace2-/-小鼠出現(xiàn)與棕色大熊貓相似的黑素體數(shù)量顯著減少和截面積顯著減小。綜合以上所有信息，研究人員推斷Bace2基因的25bp缺失最可能是導(dǎo)致大熊貓出現(xiàn)棕白色毛色變異的原因，這也是首次報(bào)道Bace2基因突變影響了野生動(dòng)物的毛色變異。
該研究首次揭示了全球罕見的棕白色大熊貓的毛色變異由Bace2基因缺失突變導(dǎo)致，并通過減小黑素體數(shù)量和大小的方式使得原本的黑色毛發(fā)呈現(xiàn)棕色，為圈養(yǎng)繁育棕色大熊貓?zhí)峁┝岁P(guān)鍵的科學(xué)基礎(chǔ)。該基因缺失突變在大熊貓?bào)w內(nèi)具體通過何種分子通路影響毛發(fā)中的黑素體數(shù)量和大小，還需要進(jìn)一步的深入研究。
相關(guān)研究成果于2024年3月4日以“Taking a color photo: A homozygous 25-bp deletion in Bace2 may cause brown-and-white coat color in giant pandas”為題在美國國家科學(xué)院院刊（PNAS）發(fā)表。該研究得到了國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院B類先導(dǎo)專項(xiàng)、江西省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目和中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)等項(xiàng)目資助。
供稿：林學(xué)院 科技處 審核：游金明
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